ПЦР анализ что

Содержание

Диагностика энтеробиоза

До 70 % среди всех гельминтозов занимает энтеробиоз. Своевременная диагностика заболевания и адекватное лечение гарантирует полное очищение организма от остриц за короткое время. Анализ на энтеробиоз включает в себя микроскопию соскоба, кала и мазка. Наиболее достоверным методом, применяемым при диагностике заболевания с целью обнаружения яиц паразитов, является соскоб и мазок со складок перианальной области.

После спаривания самцы паразитов погибают, а самки теряют способность прикрепляться к стенке кишечника и продвигаются в прямую кишку, выползают из ануса и откладывают яйца в перианальных складках, после чего погибают. Часть самок остриц выделяется во внешнюю среду с испражнениями, поэтому при постановке диагноза решающую роль играют лабораторные исследования соскобов со складок перианальной области и обнаружение самих паразитов в кале. Острицы можно обнаружить при осмотре заднего прохода вечером — через 1 — 2 часа после отхода ко сну.

Зуд в перианальной области является патогомоничным симптомом при острицах. Чаще всего он возникает вечером и ночью, когда самки выползают из прямой кишки наружу для откладывания яиц. Его причиной является секрет, который самки остриц выделяют во время откладывания яиц. Зуд в перианальной области отмечается при геморрое, половом трихомониазе, раке прямой кишки, сахарном диабете, проктите, некоторых заболеваниях печени и почек, нейродермите и кандидамикозе.

Достоверным признаком энтеробиоза является обнаружение яиц паразитов в перианальных складках и самих остриц в испражнениях.

Рис. 1. Острицы в просвете кишечника. Фото сделано при эндоскопическом обследовании.

Рис. 2. Для отложения яиц самки остриц выползают наружу. В этот момент их можно увидеть невооруженным глазом.

Кал на энтеробиоз

При энтеробиозе часть остриц выделяется наружу с каловыми массами. Они хорошо просматриваются на поверхности свежевыделенного кала. Яйца в кале обнаруживаются редко. Поможет обнаружить острицы небольшая клизма с холодной водой. Паразиты попадают вместе с вытекающей водой в емкость (лучше темного цвета).

Анализ кала на энтеробиоз обладает низкой степенью достоверности — около 20%. Его преимущества заключаются в том, что попутно можно выявить другие паразиты.

Некоторые установки по сбору кала на исследование:

  • Накануне сбора кала на исследование нельзя принимать слабительные средства и ставить клизму.
  • Перед актом дефекации следует опорожнить мочевой пузырь.
  • Не подмываться.
  • Сбор кала осуществлять в специальный контейнер.
  • Забор кала осуществляется мерной ложечкой с трех сторон и середины каловой массы.
  • Собранный материал погружается в контейнер.
  • Доставлять собранный материал в лабораторию необходимо в течение суток.
  • При необходимости емкость с собранным материалом лучше хранить в холодильнике.

Рис. 3. Острицы в кале.

Рис. 4. Яйца остриц. Свежий мазок фекалий.

Рис. 5. Емкости для сбора материала на исследование.

Анализ на энтеробиоз в домашних условиях

Сбор диагностического материала с применением прианального соскоба или с помощью ватной палочки разрешено проводить в домашних условиях.

Соскоб на энтеробиоз и мазок необходимо проводить утром до проведения гигиенических процедур.

Как сдавать анализ на энтеробиоз в домашних условиях с применением липкой ленты

  • Снимите ребенку штанишки и трусики.
  • Уложите на бок.
  • Раздвиньте ягодицы большим и указательным пальцем.
  • Снимите липкую ленту (размером 2х5 см) с предметного стекла и приложите липкой стороной к прианальным складкам на несколько секунд.
  • Снимите ленту и приклейте ее без образования пузырьков к предметному стеклу.
  • Поместите предметное стекло в стерильный контейнер.
  • Соскоб на энтеробиоз отправьте в лабораторию.

⁕До проведения манипуляции в туалет по-большому не ходить.

⁕Липкая лента и предметное стекло приобретаются в аптеке.

⁕Манипуляцию проводить в перчатках, которые после проведения манипуляции выбрасываются. Руки тщательно моются.

Рис. 10. Процедура взятия соскоба на энтеробиоз с помощью липкой ленты.

Процедура сбора диагностического материала с помощью липкой ленты не вызывает дискомфорта у малышей.

Как сдавать анализ на энтеробиоз в домашних условиях с применением мазка

Мазок на энтеробиоз в домашних условиях осуществляется с помощью ватной палочки.

  • Ребенок укладывается на бок.
  • Ватная палочка обмакивается в глицерин (совсем чуть-чуть).
  • Делается несколько мазков по прианальным складкам.
  • Собранный материал помещается в стерильную емкость и отправляется в лабораторию.

⁕Ватные палочки и глицерин приобретаются в аптеке.

⁕До проведения манипуляции в туалет по-большому не ходить.

Рис. 11. Мазок на энтеробиоз осуществляется с помощью ватной палочки.

Доставка материала в лабораторию

Доставку материала на исследование необходимо осуществить в течение первых 2-х часов, либо хранить в холодильнике не более 8-и часов при температуре 80С.

Сколько делается анализ на энтеробиоз

Анализ на энтеробиоз проводится в течение дня. За результатом можно обращаться уже на следующий день.

При обнаружении в перианальной области взрослых особей остриц, паразиты необходимо поместить в емкость с 75% раствором этилового спирта и передать в лабораторию.

Сколько раз необходимо сдавать анализ на энтеробиоз

В ряде случаев даже при наличии паразитов в кишечнике не всегда удается обнаружить их яйца в перианальных складках. При небольшом количестве самок гельминтов кладка яиц происходит не каждую ночь. При единичном исследовании вероятность обнаружения яиц гельминтов составляет 50%, при 3-х кратном — 90%, при пятикратном — 99%.

Где можно сделать анализ на энтеробиоз

Анализ на энтеробиоз берется и производится по направлению педиатра или терапевта в лабораториях государственных учреждений здравоохранения бесплатно. В коммерческих учреждениях здравоохранения анализ производится по обращению. Его стоимость составляет 250 — 500 рублей.

Сколько действителен анализ на энтеробиоз. Справка на энтеробиоз

Анализ на энтеробиоз действителен 10 суток. Для детей, посещающих бассейн, результат анализа на энтеробиоз действителен в течение 3-х месяцев, для взрослых — 6 месяцев. После исследования при необходимости можно получить справку у терапевта о результатах исследования. На справке должен быть штамп лечебного учреждения, треугольная печать и личная печать врача.

Рис. 12. Справка результата на энтеробиоз. На ней должно быть 2 печати и штамп.

Рис. 13. Микроскопия мазка и соскоба являются основным методом диагностики энтеробиоза.

Рис. 14. На фото взрослые самки остриц. Хвостовой конец у них заострен и вытянут.

Рис. 15. На фото самцы остриц под микроскопом. Хвостовой конец у них закручен.

Рис. 16. Самка острицы и яйцо с личинками под микроскопом.

Самое популярное Предыдущая статья: О малярии Следующая статья: Диагностика энтеробиоза

Как берут соскоб на энтеробиоз у детей и взрослых: алгоритм действий

Алгоритм выполнения соскоба на энтеробиоз у взрослых таков:

  • Накануне исследования медицинская сестра или врач объясняют пациенту цель его проведения и дают рекомендации, как правильно к нему подготовиться.
  • Пациент получает направление на исследование.
  • В назначенное время он обязан прийти в лабораторию.
  • Надев стерильные перчатки, медицинская сестра достает подготовленный тампон, смоченный раствором глицерина. В некоторых лабораториях пациентов просят принести готовые тампоны с собой (их можно приобрести в аптеке).
  • Во время забора биоматериала пациент может лечь на бок, а может остаться в стоячем положении, слегка наклонившись вперед.
  • Раздвинув его ягодицы, медсестра при помощи тампона возьмет соскоб с кожных покровов, окружающих заднепроходное отверстие.
  • Поместив тампон в стерильную пробирку, медсестра доставит ее в лабораторию.

Алгоритм выполнения аналогичного соскоба у ребенка включает:

  • Объяснение сути назначенного исследования.
  • Выдачу направления.
  • Укладывание малыша на бочок. Совсем маленького ребенка во время манипуляции маме разрешается держать на руках, повернув личиком к себе.
  • Надев стерильные перчатки, медицинская сестра подготавливает небольшой кусочек специальной липкой ленты (скотча) и обезжиренное предметное стекло.
  • Осторожно раздвинув ягодицы малыша, медсестра на несколько секунд приклеивает скотч на кожные складки, окружающие анальное отверстие.
  • Сняв ленту, медсестра приклеивает ее к поверхности предметного стекла, стараясь избежать появления складочек и пузырей, мешающих проведению микроскопии.

Показания

Соскоб на энтеробиоз в обязательном порядке выполняется:

  1. Пациентам с ярко выраженной клинической картиной гельминтоза, включающей наличие:
    • сильного анального зуда, усиливающегося в ночные часы;
    • неврологической симптоматики (выражающейся ухудшением познавательных способностей, сильными головными болями, раздражительностью, повышенной утомляемостью);
    • сбоев в работе кишечника (представленных повышенным метеоризмом, неустойчивостью стула, тошнотой, резким снижением массы тела);
    • аллергических реакций (проявляющихся возникновением экземы, бронхиальной астмы и крапивницы).
  2. Для получения справки об отсутствии паразитарной инвазии, дающей право на посещение определенного учреждения. На энтеробиоз обследуются также дети, поступающие в детский сад.
  3. Больным, помещаемым в медицинский стационар.
  4. Пациентам, проходящим диспансеризацию.
  5. В рамках обязательного ежегодного обследования, которому подвергаются воспитанники детских садов, учащиеся младших классов и работники пищевой промышленности.
  6. Детям и взрослым, отправляющимся в загородный лагерь, на курорт, в профилакторий или в любое учреждение оздоровительного профиля.
  7. В случае оформления санитарной книжки.

За семь дней до выполнения соскоба пациент должен отказаться от применения касторового масла, противодиарейных препаратов и антибактериальных лекарственных средств.

Подготовка

  • Чтобы результаты соскоба на энтеробиоз были максимально информативными, биоматериал для него необходимо собрать сразу после пробуждения (в идеале – даже не вставая с постели).
  • Ни о каком подмывании, смене нижнего белья и испражнении не может быть и речи.
  • При выполнении соскоба необходимо избегать загрязнения шпателя или ватного тампона каловыми массами.
  • При значительном повреждении кожных покровов перианальной области забор биоматериала для соскоба противопоказан.

В подавляющем большинстве случаев соскоб берут в условиях поликлиники, до которой добираются пешком или на автотранспорте.

Перед этим пациенты успевают сходить в туалет и большую часть яиц, отложенных острицами, оставить на нижнем белье. Это снижает достоверность полученных результатов и затрудняет выявление энтеробиоза.

Обследование в поликлинике

Процедура классического соскоба на энтеробиоз (именуемого методом Торгушина), выполняемого средним медицинским персоналом или врачом-лаборантом в условиях поликлиники, состоит из нескольких этапов:

  • Лаборант сначала заполняет бланк направления на анализ.
  • Маленького пациента медсестра укладывает на кушетку (спиной к себе), слегка приподняв его верхнюю ножку, слегка согнутую в коленном суставе. Раздвинув ягодицы ребенка пальцами одной руки, другой рукой с зажатым в ней ватным тампоном, заранее смоченным небольшим количеством воды, 50% глицерина или масляного раствора, она совершает круговые движения по коже перианальных складок.
  • Взрослый пациент во время забора биоматериала может стоять, слегка наклонившись вперед.
  • Тампон с взятым материалом помещают внутрь одноразовой пластиковой или стеклянной пробирки, плотно ее укупоривают и маркируют. Максимальный срок хранения биоматериала (при температуре, не превышающей восьми градусов Цельсия) – не более 2 часов.
  • После того как пробирка окажется в лаборатории, тампон извлекают, а материал штрихами наносят на поверхность стерильного обезжиренного предметного стекла (с капелькой глицерина). Препарат, подготовленный таким образом, рассматривают под микроскопом.
  • Полученный результат заносят в специальный журнал и в бланк направления на исследование.
  • Заполненное направление доставляют в участок.

Соскоб на энтеробиоз может быть выполнен по методике Кеворковой, предусматривающей промывание тампона в специальном растворе с последующим помещением его в центрифугу. Осадок, оставшийся на дне пробирки после центрифугирования, переносят на предметное стекло и рассматривают под микроскопом.

Если биоматериал был взят при помощи шпателя, покрытого очень клейким веществом, его аккуратно соскабливают, переносят на лабораторное стекло и приступают к микроскопированию.

Дома

Выполнить соскоб на энтеробиоз в домашних условиях можно несколькими способами:

  1. При помощи ватной палочки:
    • Сначала необходимо купить в аптеке стерильный контейнер для кала и упаковку ватных палочек.
    • Ранним утром (до момента мочеиспускания и дефекации) нужно тщательно вымыть руки и надеть на них медицинские перчатки.
    • Смочив ватную палочку чистой водой, физиологическим раствором или глицерином, следует встать, слегка наклонившись вперед.
    • Сделав палочкой несколько радиальных движений в области перианальных складок, отправляют ее в стерильный контейнер и плотно закручивают его крышку.
    • Взятый биоматериал незамедлительно доставляют в бактериологическую лабораторию.
  2. При помощи прозрачной липкой ленты. В среде медиков эта методика взятия биоматериала именуется методом Грэхема.
    • Чтобы выполнить соскоб согласно этой методике, в аптеке нужно купить специальный комплект, состоящий из липкой ленты и предметного стекла.
    • Хорошенько вымыв руки, необходимо надеть на них стерильные перчатки.
    • До момента взятия биоматериала следует воздержаться от дефекации и мочеиспускания.
    • Сняв липкую ленту с лабораторного стекла, нужно принять вышеописанную позу.
    • Липкую ленту на несколько секунд плотно прижимают к коже перианальных складок.
    • Ленту с полученным биоматериалом снимают с тела и аккуратно приклеивают к лабораторному стеклу.
    • Готовый препарат отправляют в лабораторию.
  3. При помощи шпателя.
    • Чтобы воспользоваться этим способом получения биоматериала, в аптеке приобретают особый контейнер с завинчивающейся крышечкой, содержащий полистироловый шпатель, на лопасть которого уже нанесен тонкий слой клея на водной основе.
    • Вымыв руки и надев одноразовые перчатки, липкую сторону шпателя плотно прижимают к складкам, расположенным вокруг ануса.
    • После сбора материала шпатель помещают в контейнер, завинчивают крышечку и транспортируют в лабораторию.

Видео покажет как сделать соскоб на энтеробиоз в домашних условиях:

Сколько дней делается?

Результат соскоба на энтеробиоз чаще всего можно узнать ровно через сутки после взятия биоматериала.

Как правило, соскоб выполняют в утренние часы: с 8-00 до 10-00. Все это время собранные биоматериалы находятся в холодильнике (температура их хранения должна быть не выше восьми градусов). Закончив прием анализов, медсестра доставляет собранный биоматериал в бактериологическую лабораторию.

Рассматривая под микроскопом образцы, полученные от пациента, зараженного энтеробиозом, лаборанты в поле зрения могут выявить яйца остриц: бесцветные, имеющие довольно неправильную округлую форму и некоторую асимметрию (одна их сторона является плоской, другая – выпуклой). Оболочка яиц является двухконтурной. Внутри яиц хорошо просматривается еще не созревшая личинка.

Само по себе микроскопирование образцов, направленное на выявление энтеробиоза, занимает лишь несколько минут, поэтому в большинстве платных лабораторий результаты исследования можно получить в течение 15-20 минут после выполнения соскоба.

Некоторым пациентам также удается договориться с сотрудниками государственных поликлиник о возможности получения результата в день сдачи анализа.

Расшифровка результатов

  • Показателем нормы является полное отсутствие яиц интересующего нас вида гельминтов при микроскопическом исследовании образца.
  • Отрицательный результат далеко не всегда может свидетельствовать о полном излечении больного или об отсутствии энтеробиоза у человека, сдавшего соскоб, поскольку проверка может совпасть с самым началом заражения, когда молодая самка еще не успела созреть для откладывания яиц или с «немым» периодом, во время которого самка еще не выполнила кладку. Для того чтобы диагностировать энтеробиоз, специалисты рекомендуют выполнить серию (от трех до семи раз) повторных анализов, интервалы между которыми не должны превышать 2-3 дней.
  • Как показывают исследования, информативность соскоба, выполненного однократно, составляет не более 50%. Трехкратное микроскопирование биоматериалов позволяет улучшить этот показатель до 90%.
  • Получение положительного результата дает основание для подтверждения диагноза. Большим недостатком соскобов на энтеробиоз, проводимых в российских лабораториях, являются заключения, указывающие лишь на то, что в исследованных образцах обнаружены яйца остриц и не содержащие никаких количественных характеристик. Даже общие фразы (типа «в незначительном количестве» или «большое число»), содержащиеся в заключении, могли бы помочь врачам подобрать верную тактику лечения, скорректировать дозировку применяемых медикаментозных препаратов и длительность терапевтического курса.
  • И отрицательный, и положительный результат на наличие остриц не является свидетельством отсутствия в организме пациента гельминтов других видов. Наряду с энтеробиозом он может страдать описторхозом, аскаридозом, тениидозом, токсокарозом, эхинококкозом и еще целым рядом опаснейших паразитарных инвазий, широко распространенных на территории нашей страны. Именно поэтому пациент, получивший отрицательный результат соскоба на энтеробиоз, несмотря на наличие симптоматики, красноречиво указывающей на присутствие гельминтов в его организме, должен проявить настороженность и пройти через целый ряд повторных исследований каловых масс.

Срок действия

Результат исследования на энтеробиоз является действительным на протяжении семи дней. Столь короткий срок действия объясняется особенностями жизненного цикла остриц.

Как лечить, если результат положительный?

При получении положительного результата на энтеробиоз приступать к лечению больного следует незамедлительно.

Терапию энтеробиоза осуществляют препаратами, обладающими широким спектром действия, представленными:

  • Орнидазолом.
  • Альбендазолом.
  • Метронидазолом.
  • Тинидазолом.

Высокую эффективность в лечении недуга показал противоглистный препарат «Гельминтостоп».

В домашних условиях можно приготовить отвары и настойки на основе полыни, березовых почек и пижмы, рекомендованные для употребления внутрь и обладающие хорошо выраженным глистогонным действием.

Помимо медикаментозной терапии большое значение имеют следующие моменты:

  • Правила личной гигиены в период лечения недуга должны неукоснительно соблюдаться как самим больным, так и окружающими его людьми.
  • Стирать белье больного необходимо не менее получаса в воде, температура которой не ниже восьмидесяти градусов. Высохшее белье следует обязательно прогладить горячим утюгом.
  • Влажная уборка с применением специальных дезинфицирующих средств в помещении, где проживает страдающий энтеробиозом человек, должна быть ежедневной. Особой обработки заслуживает туалетная комната, прихожая и ручки на дверях.
  • Все игрушки больного малыша необходимо ежедневно обрабатывать дезинфицирующим раствором.

Видео-передача о том, что такое энтеробиоз:

История

В начале 1970-х годов норвежский учёный Хьелль Клеппе из лаборатории нобелевского лауреата Хара Гобинды Кораны предложил способ амплификации ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК — синтетических праймеров. Однако в то время эта идея осталась нереализованной. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была изобретена в 1983 году американским биохимиком Кэри Муллисом . Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Первая публикация по методу ПЦР появилась в ноябре 1985 года в журнале Science. Метод революционизировал молекулярную биологию и медицину. В 1993 году Кэри Муллис получил за это Нобелевскую премию по химии..

В начале использования метода после каждого цикла нагревания-охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура проведения реакции была сравнительно неэффективной, требовала много времени и фермента. В 1986 году метод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq-полимеразой. Недостаток этой полимеразы заключается в довольно высокой вероятности внесения ошибочного нуклеотида, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3’→5′-экзонуклеазная активность). Полимеразы Pfu и Pwo, выделенные из архей, таким механизмом обладают; их использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у Taq. Сейчас применяют смеси Taq и Pfu, чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования.

В момент изобретения метода Кэри Муллис работал химиком-синтетиком (он синтезировал олигонуклеотиды, которые применялись тогда для выявления точечных мутаций методом гибридизации с геномной ДНК) в компании Цетус (Cetus Corporation), которая и запатентовала метод ПЦР. В 1992 году Цетус продала права на метод и патент на использование Taq-полимеразы компании Хофман-Ла Рош за 300 млн долларов. Однако оказалось, что Taq-полимераза была охарактеризована советскими биохимиками А. Калединым, А. Слюсаренко и С. Городецким в 1980 году, а также за 4 года до этой советской публикации, то есть в 1976 году, американскими биохимиками Alice Chien, David B. Edgar и John M. Trela. В связи с этим компания Promega пыталась в судебном порядке заставить Рош отказаться от исключительных прав на этот фермент. Американский патент на метод ПЦР истёк в марте 2005 года.

Проведение ПЦР

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка нуклеиновой кислоты ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20—40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований.

Компоненты реакции

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

  • ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
  • Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
  • Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза), Thermus thermophilus (Tth-полимераза) и другие.
  • Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
  • Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
  • Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию.

Праймеры

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18—30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка.

После гибридизации матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы (см. ниже).

Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления (Tm) комплекса праймер-матрица.

Tm — температура, при которой половина ДНК-матриц образует комплекс с олигонуклеотидным праймером. Усредненная формула подсчета Tm для короткого олигонуклеотида (и для длинных фрагментов ДНК), с учётом концентрации ионов K+ и DMSO:

T m = 77 , 1 + 11 , 7 lg ⁡ + 41 ( G + C ) − 528 L − 0 , 75 {\displaystyle T_{m}=77,1+11,7\lg+{\frac {41(G+C)-528}{L}}-0,75} ,

где L — количество нуклеотидов в праймере, K+ — молярная концентрация ионов калия, G+C — сумма всех гуанинов и цитозинов.

В случае неверного выбора длины и нуклеотидного состава праймера или температуры отжига возможно образование частично комплементарных комплексов с другими участками матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Верхний предел температуры плавления ограничен оптимумом температуры действия полимеразы, активность которой падает при температурах выше 80 °C.

При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев:

  • GC-состав ~ 40—60 %;
  • близкие Tm праймеров (отличия не более, чем на 5 °C);
  • отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек и димеров;
  • желательно, чтобы на 3’-конце был гуанин или цитозин, поскольку они образуют три водородные связи с молекулой матрицы, делая гибридизацию более стабильной.

Амплификатор

Основная статья: АмплификаторАмплификатор для проведения ПЦР

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР (см. ниже) и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

Ход реакции

Фотография геля, содержащего маркерную ДНК (первый и последний слоты) и продукты ПЦР

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий (рис. 2).

Денатурация

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется плавлением (денатурацией), так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Обычно перед первым циклом проводят длительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин для полной денатурации матрицы и праймеров.

Отжиг

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 5 градусов меньше, чем температура плавления праймеров. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре). Время стадии отжига — 30 сек, одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов. Поэтому рекомендуется подбирать праймеры с температурой плавления выше 60 °C и проводить отжиг и элонгацию одновременно, при 60—72 °C.

Элонгация

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3′-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5′- к 3′-концу. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 мин.

Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2n — 2n, где n — число циклов реакции. На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100 %, поэтому в действительности P ~ (1+E)n, где P — количество продукта, Е — средняя эффективность цикла.

Число «длинных» копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент.

Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато».

Разновидности ПЦР

  • RPA (англ. Recombinase Polymerase Amplification — Рекомбиназная полимеразная амплификация) — применяется там где амплификация ДНК / РНК необходима в течение 15 минут без термоциклера (изотермальная реакция)
  • Вложенная ПЦР (Nested PCR (англ.)) — применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.
  • Инвертированная ПЦР (Inverse PCR (англ.)) — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов (лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.
  • ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR (англ.)) — используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную кДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.
  • Асимметричная ПЦР (англ. Asymmetric PCR) — проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке. Модификаций этого метода является англ. Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR), в котором используются праймеры с разной концентрацией, и праймер с низкой концентрацией подбирается с высокой (температурой плавления), чем праймер с высокой концентрацией. ПЦР проводят при высокой температуре отжига, тем самым удаётся поддержать эффективности реакции на протяжении всех циклов.
  • Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR (англ.)) или ПЦР в реальном времени — используется для непосредственного наблюдения за измерением количества конкретного ПЦР продукта в каждом цикле реакции. В этом методе используют флуоресцентно-меченые праймеры или ДНК-зонды для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления; или используется флуоресцентный интеркалирующий краситель Sybr Green I (но лучше использовать SYTO 13), который связывается с двухцепочечной ДНК. Sybr Green I обеспечивает простой и экономичный вариант для детекции и количественного определения ПЦР-продуктов в ходе ПЦР в режиме реального времени без необходимости использования специфичных флуоресцентных зондов или праймеров. В ходе амплификации краситель SYBR Green I встраивается в малую бороздку ДНК продуктов ПЦР и испускает более сильный по сравнению с несвязанным красителем флуоресцентный сигнал при облучении синим лазером. SYBR Green I совместим со всеми известными на сегодняшний день приборами для проведения ПЦР в режиме реального времени. Максимум поглощения для SYBR Green I находится при длине волны 494 нм. Кроме главного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения — при 290 нм и 380 нм. Максимум испускания для SYBR Green I находится при длине волны 521 нм (зелёный).
  • Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR (англ.)) — с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров. Первые циклы проводят при температуре выше оптимальной температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру отжига постепенно снижают до оптимальной. Это делается для того, чтобы праймер гибридизовался с комплементарной цепью всей своей длиной; тогда как при оптимальной температуре отжига, праймер частично гибридизуется с комплементарной цепью. Частичная гибридизация праймера на геномной ДНК приводит к неспецифической амплификации, если участков связывания для праймера достаточно много. В большинстве случаев первые десять циклов ПЦР можно проводить при температуре отжига в 72-75°С, а затем сразу снизить до оптимальной, например до 60-65°С.
  • Метод молекулярных колоний (ПЦР в геле, англ. Colony — PCR Colony) — акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.
  • ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (англ. Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR).
  • ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) — модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований). Используют смесь двух полимераз, одна из которых — Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК-полимераза с 3′-5′-экзонуклеазной активностью, обычно это полимераза Pfu. Вторая полимераза необходима для коррекции ошибок, внесённых первой, так как Taq-полимераза останавливает синтез ДНК, если был добавлен некомплементарный нуклеотид. Этот некомплементарный нуклеотид удаляет Pfu-полимераза. Смесь полимераз берется в отношении 50:1 или даже меньше 100:1, где Taq-полимеразы берётся в 25—100 раз больше, чем Pfu-полимеразы.
  • RAPD (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA), ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК — используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (около 10 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удаётся добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов.
  • Групп-специфическая ПЦР (англ. group-specific PCR) — ПЦР для родственных последовательностей внутри одного или между разными видами с использованием консервативных праймеров к этим последовательностям. Например, подбор универсальных праймеров к рибосомальным генам 18S и 26S для амплификации видоспецифического межгенного спейсера: последовательность генов 18S и 26S консервативна между видами, поэтому ПЦР между этими генами будет проходить для всех исследуемых видов. Противоположностью этому методу является уникальная ПЦР (англ. unique PCR), где задача состоит в подборе праймеров для амплификации только одной последовательности изо всех родственных.
  • ПЦР с использованием горячего старта (англ. Hot-start PCR) — модификация ПЦР с использованием ДНК-полимеразы, в которой полимеразная активность блокируется при комнатной температуре антителами или имитирующими антитела небольшими молекулами типа Affibody, то есть в момент постановки реакции до первой денатурации в ПЦР. Обычно первая денатурация проводится при 95 °C в течение 10 минут.
  • Виртуальная ПЦР (англ. in silico PCR, цифровая ПЦР, электронная ПЦР, е-ПЦР) — математический метод компьютерного анализа теоретической полимеразной цепной реакции c использованием списка последовательностей праймеров (или ДНК-зондов) для предсказания потенциальной амплификации ДНК исследуемого генома, хромосомы, кольцевой ДНК или любого другого участка ДНК.

Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые основания. Например, последовательность праймера может быть такой: …ATH…, где Н — А, Т или С.

Применение ПЦР

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.

Криминалистика

ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически — одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью электрофореза ДНК. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (англ. genetic fingerprint).

Установление отцовства

Рис. 3: Результаты электрофореза ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР. (1) Отец. (2) Ребёнок. (3) Мать. Ребёнок унаследовал некоторые особенности генетического отпечатка обоих родителей, что дало новый, уникальный отпечаток.

Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны (за исключением случая однояйцевых близнецов), родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков (рис. 3). Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов.

Медицинская диагностика

ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания.

Персонализированная медицина

Иногда лекарства оказываются токсичными или аллергенными для некоторых пациентов. Причины этого — отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных. Эти различия детерминируются на генетическом уровне. Например, у одного пациента определенный цитохром (белок печени, отвечающий за метаболизм чужеродных веществ) может быть более активен, у другого — менее. Для того, чтобы определить, какой разновидностью цитохрома обладает данный пациент, предложено проводить ПЦР-анализ перед применением лекарства. Такой анализ называют предварительным генотипированием (англ. prospective genotyping).

Клонирование генов

Клонирование генов (не путать с клонированием организмов) — это процесс выделения генов и, в результате генноинженерных манипуляций, получения большого количества продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор — фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена — РНК или, чаще всего, белка. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др.

Рис. 4: Клонирование гена с использованием плазмиды.
(1) Хромосомная ДНК организма A. (2) ПЦР. (3) Множество копий гена организма А. (4) Вставка гена в плазмиду. (5) Плазмида с геном организма А. (6) Введение плазмиды в организм В. (7) Умножение количества копий гена организма А в организме В.

Секвенирование ДНК

Основная статья: Секвенирование

В методе секвенирования с использованием меченных флуоресцентной меткой или радиоактивным изотопом дидезоксинуклеотидов ПЦР является неотъемлемой частью, так как именно в ходе полимеризации в цепь ДНК встраиваются производные нуклеотидов, меченные флуоресцентной или радиоактивной меткой. Присоединение дидезоксинуклеотида к синтезируемой цепи приводит к обрыву синтеза, позволяя определить положение специфических нуклеотидов после разделения в геле.

Мутагенез

Основная статья: Мутагенез

В настоящее время ПЦР стала основным методом проведения мутагенеза (внесения изменений в нуклеотидную последовательность ДНК). Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой.

Примечания

  1. Kleppe, K. et al. (1971): Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA’s as catalyzed by DNA polymerases. In: J. Mol. Biol. Bd. 56, S. 341—361. PMID 4927950
  2. Bartlett, J. M. S. A Short History of the Polymerase Chain Reaction // PCR Protocols / J. M. S. Bartlett, D. Stirling. — 2nd. — 2003. — Vol. 226. — P. 3–6. — ISBN 1-59259-384-4. — DOI:10.1385/1-59259-384-4:3.
  3. Mullis, Kary B. et al. «Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences» U.S. Patent 4 683 195
  4. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. Science 1985 Dec 20; 230 (4732): 1350-4; Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
  5. Нобелевские лауреаты по химии, 1993 г. (англ.)
  6. R. K. Saiki, D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, H. A. Erlich. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase Архивная копия от 19 декабря 2008 на Wayback Machine. in: Science. 239.1988, 487—491. ISSN 0036-8075 PMID 2448875
  7. Каледин А. С., Слюсаренко А. Г., Городецкий С. И. // Биохимия. — 1980. — T. 45. — C. 644—651.
  8. Alice Chien, David B. Edgar и John M. Trela. Deoxyribonucleic Acid Polymerase from Extreme Thermophilic Thermus aquaticus. Jourmal of Bacteriology, Sept. 1976, pp. 1550—1557.
  9. Roche announces settlement agreement with Promega (недоступная ссылка). Дата обращения 29 августа 2007. Архивировано 6 октября 2008 года.
  10. 1 kbp (kilo base pair (англ.)) — 1 тысяча пар оснований, единица измерения длины ДНК
  11. Venter J, et al. (2001). «The sequence of the human genome». Science 291 (5507): 1304-51. PMID 11181995
  12. {title} (недоступная ссылка). Дата обращения 1 сентября 2007. Архивировано 29 сентября 2007 года.
  13. Отжиг (англ. annealing) — гибридизация фрагментов ДНК
  14. Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Schütz (2001). “Oligonucleotide melting temperatures under pcr conditions: nearest-neighbor corrections for Mg2+, deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas”. Clinical Chemistry. 47 (11): 1956–1961.
  15. Шпилька — внутримолекулярная самокомплементарная структура
  16. Димер — межмолекулярные структуры, образуемые праймерами друг с другом или сами с собой
  17. Календарь РН, Сиволап ЮМ (1995). “Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами” (PDF). Биополимеры и клетка. 11 (3–4): 55–65. ISSN 0233-7657.
  18. Recombinase Polymerase Amplification (RPA) — the isothermal DNA/RNA amplification that really works.
  19. Видео на англ.: What is Recombinase Polymerase Amplification? — TwistDx
  20. Pierce KE and Wangh LJ (2007). “Linear-after-the-exponential polymerase chain reaction and allied technologies Real-time detection strategies for rapid, reliable diagnosis from single cells”. Methods Mol Med. Methods in Molecular Medicine™. 132: 65—85. DOI:10.1007/978-1-59745-298-4_7. ISBN 978-1-58829-578-1. PMID 17876077.
  21. Fluorescence SpectraViewer Fluorescence SpectraViewer | Life Technologies. Дата обращения 30 октября 2012.
  22. United States Patent 7,972,820. July 5, 2011. Isothermal amplification of nucleic acids on a solid support

ПЦР-анализ: что это такое, когда он назначается и как проводится


ПЦР — метод лабораторной диагностики, позволяющий определить наличие возбудителя болезни, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул его ДНК.

Благодаря ПЦР-методу можно выявить различные вирусные инфекции, такие как гепатит, ВИЧ, герпес, хламидиоз и другие.
Где проводят анализы методом ПЦР?

Для того чтобы результаты анализов были максимально достоверными, необходимо правильно подготовиться к их сдаче.
Как подготовиться?

Комфорт — превыше всего. Сдать все необходимые анализы можно не выходя из дома.
Вызвать специалиста на дом…

Спецпредложения, скидки и акции помогут существенно сэкономить на медицинском обследовании.
Посмотреть текущие акции…

Высокотехнологичные лабораторные методы диагностики дают возможность выявить множество заболеваний на самых ранних стадиях. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) — один из самых новых и точных способов диагностики. За его разработку ученый Кэри Муллис получил в 1993 году Нобелевскую премию. Сегодня этот метод хотя и считается экспериментальным, но уже широко и успешно применяется в медицине.

ПЦР-диагностика: суть подхода

Метод ПЦР использует принципы молекулярной биологии. Его суть заключается в применении особых ферментов, которые многократно копируют фрагменты РНК и ДНК возбудителей болезни, которые находятся в пробах биоматериала, например в крови.

После этого работники лаборатории сверяют полученные фрагменты с базой данных, выявляют тип возбудителя болезни и его концентрацию.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, охлаждающем и нагревающем пробирки с пробами биоматериала. Нагрев и охлаждение необходимы для проведения репликации. Точность температурного режима влияет на точность результата.

Сферы применения метода

Диагностические возможности метода ПЦР огромны, с его помощью можно выявить самые разные инфекции. Чаще всего ПЦР-метод применяют для диагностики:

  • ВИЧ;
  • герпеса;
  • различных половых инфекций, в частности хламидиоза, уреаплазмоза, гарднереллеза, микоплазмоза и трихомониаза;
  • кандидоза;
  • гепатитов;
  • мононуклеоза;
  • листериоза;
  • цитомегаловируса;
  • туберкулеза;
  • вируса папилломы человека;
  • клещевого энцефалита.

Это далеко не полный список, метод ПЦР-анализа используется в разных областях медицины.

Кстати
Метод ПЦР применяется не только в медицинских целях. В наши дни он используется и в иных сферах, например в криминалистике, в тех случаях, когда требуется определить, кому принадлежит найденный на месте преступления биоматериал. ПЦР иногда используется также при установлении отцовства.

Преимущества и недостатки подхода

У диагностики методом ПЦР много плюсов:

Высокая чувствительность. Метод позволяет выявить возбудителя болезни даже при наличии нескольких молекул его ДНК, то есть на очень ранних стадиях, при хронической форме заболевания, а так же в случаях, когда болезнь никак себя не проявляет, протекая латентно.

Универсальность. Для проведения ПЦР анализа подходит почти любой биоматериал — от крови и слюны до клеток кожи.

Широкий охват. Исследование одного образца может выявить сразу нескольких возбудителей болезни.

Оперативность. Результат, как правило, готов через 5–7 часов, то есть получить заключение можно уже на следующий день после забора биоматериала.

Точность. Метод ПЦР практически никогда не дает ложноположительных или ложноотрицательных результатов, если была соблюдена технология проведения этого анализа.

Невысокая стоимость. По цене ПЦР-анализ сравним с любыми другими лабораторными анализами крови.

Однако следует понимать, что совершенных методов анализа не бывает. У ПЦР есть и минус — высокие требования к соблюдению технологии и к профессионализму лаборантов. Если образец был загрязнен, анализ может дать ложный результат. Поэтому проводить ПЦР-диагностику лучше только в самых лучших лабораториях, где внедрены системы контроля качества работы.

Исследуемый биоматериал

Для ПЦР-диагностики заболеваний на анализ берут разные виды биоматериала. Выбор зависит от типа инфекции. При анализе на ЗППП методом ПЦР берут соскоб или мазок из шейки матки или уретры, а также мочу. Для выявления герпеса, цитомегаловируса, гепатита, токсоплазмоза и ВИЧ на анализ берут кровь. При анализе на мононуклеоз и цитомегаловирус берут мазок из зева. Спинномозговая жидкость используется для анализа при поражениях нервной системы, для диагностики внутриутробных инфекций исследуются ткани плаценты, для выявления легочных инфекций — мокрота или плевральная жидкость.

Подготовка к исследованию

Подготовка к ПЦР-диагностике напрямую зависит от типа биоматериала. Кровь сдается натощак утром. Моча также сдается утром, в лабораторных условиях, в стерильный контейнер. Перед сдачей мазка или соскоба из урогенитальной области нельзя вступать в половые контакты за несколько дней до исследования, не следует проводить спринцевания. Мазок или соскоб нельзя сдавать во время менструации и в течение 2-х дней после ее окончания.

Методы ПЦР-диагностики заболеваний

Существует немало различных методик ПЦР-диагностики: ПЦР в реальном времени, секвенирование, пиросеквенирование, микрофлюидные технологии. Сейчас наиболее распространенным способом проведения анализа является ПЦР в реальном времени — этот метод практически не допускает ложноположительных результатов, к тому же срок обработки образцов при исследовании таким способом сокращается — результат можно получить уже через час.

Для пациента результат ПЦР-анализа может быть либо положительным, либо отрицательным. Отрицательный означает, что следов враждебной ДНК не обнаружено и человек здоров. Положительный подразумевает наличие фрагментов ДНК возбудителя болезни — это значит, что человек заражен и ему требуется лечение.

Нередко ПЦР-диагностика дает положительный результат, но пациент не чувствует никакого недомогания, а признаки болезни отсутствуют. Однако это означает не ошибку, а очень раннюю стадию заболевания. В этом случае необходимы дополнительные исследования и лечение. Если заболевание было диагностировано на столь ранней стадии, следует начинать терапию как можно скорее, ведь чем дальше зайдет болезнь, тем сложнее будет ее вылечить.

ПЦР-диагностика инфекций невероятно точна — она позволяет обнаружить возбудителя болезни, даже если в пробе находится всего одна-единственная молекула его ДНК. Именно это качество сделало ПЦР-анализ одним из эффективнейших диагностических инструментов как для определения наличия инфекции, так и для контроля за ходом лечения.

Где можно пройти ПЦР-диагностику на выявление инфекций?

На этот вопрос отвечает эксперт сети независимых лабораторий «ИНВИТРО»:

«ПЦР относится к высокотехнологичным автоматизированным исследованиям. Это значит, что ПЦР-диагностика требует современного (и дорогостоящего) оборудования, а также подготовленных кадров. Именно поэтому я советую выбирать серьезные, крупные лаборатории, которые могут позволить себе приобрести новейшую аппаратуру для ПЦР-диагностики. От этого зависит не только скорость получения результата, но и его достоверность.

Узнайте, есть ли в лаборатории система контроля качества. Это не пустая формальность, особенно для диагностических лабораторий — такие системы исключают риск ошибки по вине человека. Например, в лабораториях сети «ИНВИТРО» внедрена многоуровневая система контроля качества, которая соответствует требованиям международных стандартов ИСО 15189 и ИСО 9001″.

P.S. «ИНВИТРО» — крупнейшая частная сеть лабораторий страны, проводит более 1000 видов исследований. Ежедневно ее пациентами становятся 24 000 человек. Результаты анализов признаются всеми медицинскими учреждениями России.

Преимущества метода ПЦР диагностики как метода диагностики инфекционных заболеваний

Прямое определение наличия возбудителей

Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.

Высокая специфичность

Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от иммунологических методов анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.

Высокая чувствительность

Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР анализ обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР анализа составляет 10-100 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов — 103-105 клеток).

Универсальность процедуры выявления различных возбудителей

Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы.

Высокая скорость получения результата анализа

Для проведения ПЦР анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-5 часов.

Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.

Материалом для осуществления ПЦР-диагностики могут служить

  • Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек. Обычно используются для диагностики заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП), таких как гонорея, хламидиоз, микоплазмоз, уреаплазмоз, трихомониаз, гарднереллез, герпетическая и другие инфекции, поражающие слизистые оболочки.
  • Моча. Моча может использоваться при инфекционном поражении мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин (у мужчин использование в качестве материала мочи заменяет эпителиальный соскоб).
  • Мокрота. Мокрота используется для диагностики туберкулеза и реже для диагностики респираторных форм хламидиоза и микоплазмоза. Мокроту в количестве 15-20 мл собирают в стерильный (одноразовый) флакон.
  • Кровь, плазма, сыворотка. Используются для ПЦР анализа вирусов гепатитов B, C, D, G, герпеса, ЦМВ, ВИЧ, исследования генов человека.
  • Биологические жидкости. Сок простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, слюна забираются по показаниям.
  • Биоптаты. Чаще всего используют биоптаты желудка и двенадцатиперстной кишки для выявления хеликобактерной инфекции.

Стоимость ПЦР анализа в нашем медцентре

Название исследования Клинический материал Результат Срок испол. Цена
БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ИНФЕКЦИИ
Хламидии
ДНК Chlamydia trachomatis соскоб урогенит. тракта, секрет простаты, сперма, моча, мазок с коньюнктивы, мазок из ротоглотки, синовиальная жидкость кач. 2 р.д. 190,00р.
ДНК Chlamydia trachomatis соскоб урогенит. тракта, моча, мазок из влагалища кол. 3 р.д. 560,00р.
Микоплазмы
ДНК Mycoplasma hominis соскоб из урогенит. тракта секрет простаты, сперма, моча кач. 2 р.д. 190,00р.
ДНК Mycoplasma hominis соскоб из урогенитального тракта кол. 3 р.д. 360,00р.
ДНК Mycoplasma genitalium соскоб урогенит. тракта, секрет простаты, сперма, моча кач. 2 р.д. 190,00р.
ДНК Mycoplasma genitalium соскоб урогенит. тракта, моча, мазок из влагалища кол. 3 р.д. 560,00р.
Уреаплазмы
ДНК U.urealyticum / U. parvum соскоб из урогенит. тракта, моча, секр. простаты, сперма кач. 2 р.д. 190,00р.
ДНК U.urealyticum / U. parvum соскоб урогенит. тракта кол. 3 р.д. 420,00р.
Гарднереллы
ДНК Gardnerella vaginalis соскоб из урогенит. тракта кач. 2 р.д. 190,00р.
Трепонемы
ДНК Treponema pallidum соскоб из урогенит. тракта, секрет простаты кач. 2 р.д. 190,00р.
Нейссерии
ДНК Neisseria gonorrhoeae соскоб из урогенит. тракта, моча, секрет простаты, сперма кач. 2 р.д. 190,00р.
ДНК Neisseria gonorrhoeae соскоб из урогенитального тракта, моча, мазок из влагалища кол. 3 р.д. 630,00р.
Микобактерии
ДНК Mycobacterium tuberculosis complex секрет простаты, сперма, моча, мокрота, СМЖ, БАЛ, ПЖ, синовиальная жидкость кач. 2 р.д. 290,00р.
Стрептококки группы А
ДНК Streptococcus pyogenes (Стрептококки группы А) мазок из ротоглотки кач. 2 р.д. 290,00р.
Стрептококки группы В
ДНК Streptococcus agalactia (SGB) соскоб из урогенитального тракта, моча кол. 2-3 р.д. 260,00р.
ДНК Streptococcus agalactia (SGB) кровь с ЭДТА кол. 3 р.д. 630,00р.
ДНК Streptococcus agalactia (SGB) мазок из ротоглотки, мокрота, БАЛ, СМЖ кол. 3 р.д. 630,00р.
Листерии
ДНК Listeria monocytogenes СМЖ, АЖ кач. 2 р.д. 420,00р.
ДНК Listeria monocytogenes кровь с ЭДТА кач. 4 р.д. 420,00р.
ДНК Listeria monocytogenes кал кач. 3 р.д. 440,00р.
Коклюш
ДНК Bordetella pertussis/parapertussis/bronchiseptica мазок из носа/зева, аспират, мокрота, БАЛ кач. 3 р.д. 1260,00р.
КИШЕЧНЫЕ ИНФЕКЦИИ
ДНК Campylobacter species кал кач. 4 р.д. 440,00р.
ДНК Salmonella species кал кач. 4 р.д. 440,00р.
ДНК Shigella + E. coli (энтероинвазивные штаммы) кал кач. 4 р.д. 760,00р.
ДНК Salmonella/Shigella / Campylobacter / Adenovirus кал кач. 3 р.д. 830,00р.
РНК Rotavirus / Astrovirus / Norovirus / Enterovirus кал кач. 3 р.д. 950,00р.
Диарогенные эшерихиозы кал кач. 3 р.д. 730,00р.
ГРИБКОВЫЕ ИНФЕКЦИИ И ПРОСТЕЙШИЕ
Кандида
ДНК Candida albicans соскоб из урогенит. тракта кач. 2 р.д. 190,00р.
Токсоплазма
ДНК Toxoplasma gondii СМЖ, АЖ кач. 2 р.д. 390,00р.
ДНК Toxoplasma gondii кровь с ЭДТА кач. 4 р.д. 390,00р.
Трихомонады
ДНК Trichomonas vaginalis соскоб из урогенит. тракта, секрет простаты, моча кач. 2 р.д. 190,00р.
ДНК Trichomonas vaginalis соскоб из урогенит. тракта, моча, мазок из влагалища кол. 3 р.д. 390,00р.
Пневмоцисты
ДНК Pneumocystis jirovecii (carinni) мазок из ротоглотки, мокрота, БАЛ кач. 3 р.д. 320,00р.
ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ
Гепатит A
РНК HAV кровь с ЭДТА кач. 4 р.д. 440,00р.
Гепатит В
ДНК HBV биоптат кач. 7 р.д. 440,00р.
ДНК HBV кровь с ЭДТА кач. 4 р.д. 440,00р.
ДНК HBV кровь с ЭДТА кол. 7 р.д. 1420,00р.
ДНК HBV кровь с ЭДТА ген. 10 р.д 1160,00р.
ДНК вируса гепатита В (ДНК HBV), ультрачувствительный метод кровь с ЭДТА кач. 10 р.д 2100,00р.
Гепатит С
РНК HCV биоптат кач. 7 р.д. 440,00р.
РНК HCV кровь с ЭДТА кач. 4 р.д. 440,00р.
РНК HCV кровь с ЭДТА кол. 7 р.д. 1950,00р.
РНК HCV (типы 1,2,3) кровь с ЭДТА ген. 4 р.д 800,00р.
РНК HCV (типы 1а, 1b, 2, 3а, 4, 5, 6) кровь с ЭДТА ген. 10 р.д 1800,00р.
РНК вируса гепатита С (РНК HCV), ультрачувствительный метод кровь с ЭДТА кач. 10 р.д 1950,00р.
Гепатит D
РНК HDV биоптат кач. 7 р.д. 440,00р.
РНК HDV кровь с ЭДТА кач. 3 р.д. 440,00р.
Гепатит E
РНК HEV кровь с ЭДТА кач. 3 р.д. 780,00р.
Гепатит G
РНК HGV кровь с ЭДТА кач. 3 р.д. 440,00р.
Цитомегаловирус
ДНК Cytomegalovirus соскоб из урогенит. тракта, моча, мазок с коньюнктивы, мазок из ротоглотки, АЖ , СМЖ кач. 2 р.д. 190,00р.
ДНК Cytomegalovirus кровь с ЭДТА кол 4 р.д. 410,00р.
ДНК Cytomegalovirus кровь с ЭДТА (плазма) кол 10 р.д. 830,00р.
Вирус простого герпеса
ДНК Human herpes virus 1, 2 типов соскоб урогенит. тракта, мазок из ротоглотки, СМЖ, АЖ кач. 2 р.д. 190,00р.
ДНК Human herpes virus 1, 2 типов кровь с ЭДТА кач. 4 р.д. 360,00р.
Вирус герпеса VI типа
ДНК Human herpes virus 6 типа мазок из ротоглотки, СМЖ, АЖ кач. 2 р.д. 320,00р.
ДНК Human herpes virus 6 типа кровь с ЭДТА кол 4 р.д. 340,00р.
Вирус Эпштейна-Барр
ДНК Epstein-Barr virus мазок из ротоглотки, СМЖ, АЖ кач. 2 р.д. 370,00р.
ДНК Epstein-Barr virus кровь с ЭДТА кол 4 р.д. 410,00р.
Вирус Варицелла — Зостер
ДНК Varicella-Zoster virus мазок из ротоглотки, СМЖ, АЖ кач. 2 р.д. 360,00р.
ДНК Varicella-Zoster virus кровь с ЭДТА кач. 4 р.д. 360,00р.
Папилломавирус
ДНК ВПЧ 16 и 18 типов Соскоб из урогенитального тракта (цервикальный канал, шейка матки — у женщин; уретра, крайняя плоть — у мужчин) кач. 3 р.д. 190,00р.
ДНК ВПЧ 6 и 11 типов Соскоб из урогенитального тракта (цервикальный канал, шейка матки — у женщин; уретра, крайняя плоть — у мужчин) кач. 3 р.д. 190,00р.
Количество ДНК ВПЧ высокого риска (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56, 58,59,68 типы) Соскоб из урогенитального тракта женщин (цервикальный канал, шейка матки) кол. 5 р.д. 840,00р.
Количество ДНК ВПЧ 16 и 18 типов Соскоб из урогенитального тракта женщин (цервикальный канал, шейка матки) кол. 5 р.д. 440,00р.
ДНК ВПЧ высокого риска (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56, 58,59,68 типы) Соскоб из урогенитального тракта (цервикальный канал, шейка матки — у женщин; уретра, крайняя плоть — у мужчин) кач. 3 р.д. 320,00р.
ДНК ВПЧ высокого риска (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56, 58,59 типы) Соскоб из урогенитального тракта (цервикальный канал, шейка матки — у женщин; уретра, крайняя плоть — у мужчин) ген. 5 р.д. 710,00р.
ВПЧ-тест расширенный (с определением кол-ва и типа вируса) Соскоб из цервикального канала комп. 3-7 р.д. 1260,00р.
ВПЧ-ПАП-тест (комплекс тестов ВЧП расширенный с определением кол-ва и типа вируса) Соскоб из цервикального канала (стекло + пробирка) комп. 3-7 р.д. 2840,00р.
ВПЧ-ПАП-тест жидкостный (комплекс тестов ВЧП расширенный с определением кол-ва и типа вируса и ПАП-тест) Соскоб из цервикального канала жидкостный комп. 3-7 р.д. 3360,00р.
ВПЧ-тест расширенный жидкостный (с определением кол-ва и типа вируса) Соскоб из цервикального канала жидкостный комп. 3-7 р.д. 1680,00р.
ПАП-тест жидкостный Соскоб из цервикального канала жидкостный 7 р.д. 2540,00р.
Энтеровирус
РНК Enterovirus СМЖ, мазок из ротоглотки кач. 3 р.д. 530,00р.
РНК Enterovirus кровь с ЭДТА кач. 4 р.д. 420,00р.
РНК Enterovirus кал кач. 4 р.д. 530,00р.
Аденовирус
РНК Adenovirus мазок из носа/зева, мазки с конъюнктивы, СМЖ кач. 3 р.д. 530,00р.
Вирусы гриппа А и В , парагриппа 1,2,3,4 типов
Вирус гриппа А и В (РНК Myxovirus influenza) отделяемое носоглотки кач. 2 р.д. 420,00р.
Вирус парагриппа 1,2,3,4 типов (РНК Parainfluenza virus 1,2,3,4) отделяемое носоглотки кач. 2 р.д. 480,00р.
РНК вирусов гриппа А и В, парагриппа 1,2,3,4 типов (РНК Myxovirus influenza, РНК Parainfluenza virus 1,2,3,4) отделяемое носоглотки кач. 2 р.д. 790,00р.
«Вирус гриппа А, А/H1N1/СА/2009, В» (свиной грипп) мазок из носа и зева кач. 2 р.д. 1160,00р.
Парвовирус В19
ДНК Parvovirus B 19 мазок из ротоглотки, слюна, АЖ кач. 3 р.д. 770,00р.
ДНК Parvovirus B 19 кровь с ЭДТА кол. 3 р.д. 420,00р.
ВИЧ (Вирус иммунодефицита человека)
ДНК HIV кровь с ЭДТА кач. 10 р.д. 1580,00р.
РНК HIV кровь с ЭДТА кол. 10 р.д. 4410,00р.
РНК/ДНК ВИЧ 1 типа, ультрачувствительный метод Очищенные сперматозоиды 10 р.д. 9450,00р.
Вирус краснухи
РНК вируса краснухи (Rubella virus) Кровь с ЭДТА кач. 3 р.д. 730,00р.
РНК вируса краснухи (Rubella virus) Мазок из ротоглотки, амниотическая жидкость (АЖ), спинномозговая жидкость (СМЖ, ликвор) кач. 3 р.д. 800,00р.
Респираторно-синцитиальный вирус
РНК респираторно-синцитиального вируса человека (hRSV) Мазок из носа/зева, аспират, мокрота,БАЛ кач. 2 р.д. 1260,00р.
КОМПЛЕКСНАЯ ДИАГНОСТИКА ОРВИ
Диагностика ОРВИ
РНК hRSv — Respiratory Syncytial virus (респираторно-синцитиальный вирус человека)
РНК hMpv — Metapneumovirus (метапневмовирус человека)
РНК hСv- Coronavirus (коронавирус человека)
РНК hRv- Rhinovirus (риновирус человека)
ДНК hAdv — Adenovirus B, C, E (аденовирус человека групп B, C и E)
ДНК hBv — Bocavirus (бокавирус человека)
РНК hPiv — Parainfluenza virus (вирус парагриппа человека 1, 2, 3 и 4 типов)
Мазок из носа/зева, аспират, мокрота,БАЛ кач. 2 р.д. 1680,00р.

р.д. — рабочий день, кол. — количественный, кач. — качественный, ген. — генотипирование, АЖ — амниотическая жидкость, БАЛ — бронхо-альвеолярный лаваж, СМЖ — спинно-мозговая жидкость, ПЖ — плевральная жидкость

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *